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細(xì)胞培養(yǎng)過程中，我們通常會遇到各種各樣的問題，這些問題一般是多種因素造成的，如細(xì)胞密度、培養(yǎng)環(huán)境、操作方法等。2023年，普諾賽圍繞細(xì)胞培養(yǎng)問題，共舉辦了10場線上直播，吸引了萬余人觀看。直播期間，大家踴躍發(fā)言，提出了日常實(shí)驗(yàn)中遇到的問題。本期直播答疑篩選出部分問題做了詳細(xì)解答。
牙源性干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，血清會誘導(dǎo)分化嗎？
血清成份復(fù)雜，里面包含抑制分化的因子，也包含促進(jìn)分化的因子；間充質(zhì)干細(xì)胞一類成體干細(xì)胞大多可以用血清培養(yǎng)，單能干細(xì)胞，用血清不會分化；胚胎干會細(xì)胞分化。
血清的刺激分化主要與血清品質(zhì)相關(guān)，品質(zhì)高的可以維持干細(xì)胞增殖，抑制分化；品質(zhì)較低的如新生牛血清會誘導(dǎo)分化；與生產(chǎn)批次也有關(guān)系，不同批次因子含量不一，分化效果不一。
? 篩選品質(zhì)高的血清批次；
? 添加抑制分化的因子，如bFGF，EGF等；
? 及時(shí)傳代，控制密度，刺激增殖，高密度會引起分化；
? 及時(shí)換液，防止代謝累積，刺激分化；
? 控制培養(yǎng)基質(zhì)量如內(nèi)毒素、支原體、pH等等，控制環(huán)境穩(wěn)定。
LX2細(xì)胞培養(yǎng)有哪些需要注意的點(diǎn)？
細(xì)胞密度高的時(shí)候，消化3~4 min 才能完-全消化下來，細(xì)胞高密度下生長速度快，低密度下細(xì)胞增殖慢甚至死亡，建議傳代比例控制在1:2~1:4，不要超過1:4。
鏡下觀察，已經(jīng)開始生長分化的細(xì)胞漂浮
很多是什么原因？
細(xì)胞分化了之后是不會再增殖的。細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)前期，細(xì)胞還能緩慢增殖，但隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展，漂浮的細(xì)胞越來越多，這時(shí)候要分不同的情況處理：
? 如果實(shí)驗(yàn)前，細(xì)胞長得過滿，可能因?yàn)榻佑|抑制產(chǎn)生較多漂浮細(xì)胞。這種情況下，只要貼壁的細(xì)胞沒有受到影響，實(shí)驗(yàn)可以繼續(xù)；
? 另一種情況，是實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的密度合適，實(shí)驗(yàn)開始后，貼壁的細(xì)胞慢慢脫落漂浮，這種情況是不正常的，需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞狀態(tài)、實(shí)驗(yàn)所用的誘導(dǎo)試劑對細(xì)胞的影響等多方面的因素去調(diào)整。
NK-92細(xì)胞有些臟，怎么梯度離心呢？
正常培養(yǎng)的細(xì)胞系是沒有梯度離心這個(gè)概念的，梯度離心通常是用于細(xì)胞提取時(shí)，多種細(xì)胞混合在一起的一種分離措施。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的過程中會始終伴隨著細(xì)胞的死亡，細(xì)胞死亡后裂解就會產(chǎn)生碎片。這種可以通過低速離心（800 rpm，3~5 min）去除一部分，但無法完-全去除。
細(xì)胞的密度怎么判斷？
懸浮細(xì)胞需要計(jì)數(shù)來判斷。貼壁細(xì)胞可以看不同視野下細(xì)胞的密度，以大多數(shù)視野下的密度為準(zhǔn)。需要注意的是，不是所有細(xì)胞都會平鋪單層，有些細(xì)胞可能會堆疊生長，比如Hep G2。
THP-1細(xì)胞貼壁了，是怎么回事呢？
THP-1是一類單核細(xì)胞，可以在特定的情況下分化為M0型的巨噬細(xì)胞，這時(shí)的細(xì)胞就是會貼壁的。培養(yǎng)的過程中如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)了貼壁的情況，傳代的時(shí)候可以只收集漂浮的細(xì)胞。同時(shí)排查實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境、培養(yǎng)基、血清等，看看有沒有什么特定的影響因素導(dǎo)致細(xì)胞貼壁。
NK-92越養(yǎng)活力越低，怎么辦？
細(xì)胞培養(yǎng)傳代次數(shù)多了，會存在狀態(tài)越來越差的情況。可以在細(xì)胞狀態(tài)好的時(shí)候，一邊傳代，一邊凍存。NK-92細(xì)胞有很強(qiáng)的IL-2依賴性，培養(yǎng)時(shí)要注意避免過度吹打，團(tuán)塊吹散的同時(shí)，細(xì)胞也容易受損。培養(yǎng)過程中，一方面需要注意及時(shí)添加IL-2，一方面也需要注意吹打次數(shù)，一般輕輕吹2~3下將大團(tuán)吹成小團(tuán)就可以了。
貼壁細(xì)胞，會有一些亮晶晶像油一樣的東
西，這是污染了嗎？
需要結(jié)合具體的細(xì)胞及圖片具體分析。如果是一些有成脂能力的細(xì)胞，不排除是細(xì)胞培養(yǎng)的過程中受到某種刺激分化形成了脂滴。除此以外，還需要排除器皿本身的影響。最后結(jié)合顯微鏡下的圖片及視頻進(jìn)行判斷，看是否有明顯微生物的痕跡。如果上述方法都無法判斷，必要時(shí)，可以收集細(xì)胞培養(yǎng)液置于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行空培養(yǎng)，觀察是否有明顯的微生物增殖。
為什么復(fù)蘇后細(xì)胞就老化了？
細(xì)胞復(fù)蘇后老化，可能是因?yàn)榧?xì)胞凍存前的狀態(tài)不佳，以及凍存時(shí)的保存活性效果不好，這些都會影響細(xì)胞狀態(tài)，其中凍存損傷影響比較常見。建議控制凍存前狀態(tài)、控制凍存過程及凍存液確保細(xì)胞活率。
誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞，只看形態(tài)嗎？需要其他
方法進(jìn)行鑒定嗎？
一般誘導(dǎo)效果好，脂滴大，相差顯微鏡白光可以觀察到油滴，可能會存在誤判，建議使用標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，用油紅O染色方法鑒定。
懸浮細(xì)胞怎么進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染？
懸浮細(xì)胞通常是當(dāng)天按實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞量接種細(xì)胞，后續(xù)配置轉(zhuǎn)染復(fù)合物，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加到培養(yǎng)基中，根據(jù)摸索好的轉(zhuǎn)染時(shí)間，收樣檢測。
DNA和siRNA共轉(zhuǎn)染如何操作？
設(shè)置好分組，空白對照、陰性對照、陽性對照、DNA、siRNA、DNA和siRNA共轉(zhuǎn)染（用無血清培養(yǎng)基稀釋DNA和siRN及DNA，無血清培養(yǎng)基稀釋轉(zhuǎn)染試劑），摸索適宜的濃度、比例、轉(zhuǎn)染時(shí)間。
懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，易成團(tuán)，如何盡量減少成
團(tuán)？
大多數(shù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)都會聚團(tuán)，還有些懸浮細(xì)胞本身就是聚團(tuán)長的，不聚團(tuán)說明細(xì)胞活性較差，如NK-92細(xì)胞。培養(yǎng)本身是聚團(tuán)生長的懸浮細(xì)胞，是不可以減少細(xì)胞團(tuán)的。如果是存在少數(shù)聚團(tuán)，大部分單顆懸浮的細(xì)胞，可以將細(xì)胞進(jìn)行高密度培養(yǎng).一般密度在200萬/mL時(shí)，細(xì)胞大部分是單顆分散的。
NCI-929細(xì)胞復(fù)蘇后很難養(yǎng)，細(xì)胞不增殖，
怎么辦？
這是一株對營養(yǎng)要求較高的懸浮細(xì)胞，培養(yǎng)的時(shí)候需要添加β-巰基乙醇。如果細(xì)胞剛復(fù)蘇就生長緩慢，可以先用臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞的活性。如果是復(fù)蘇時(shí)生長狀態(tài)較好，但傳代后生長緩慢，可能是培養(yǎng)基的營養(yǎng)不夠，比如沒有加β-巰基乙醇等。另外，細(xì)胞不增殖可能與接種時(shí)的密度太低有關(guān)。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是有密度要求的，一般情況下密度控制在50-200萬/mL為佳，密度太低了，細(xì)胞增殖緩慢，密度太高了，細(xì)胞可能會慢慢裂解死亡。
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